手性β-氨基醇生物催化合成實驗技術

章　手性β-氨基醇概述 1
1.1　手性β-氨基醇簡介 2
1.2　手性β-氨基醇的應用 2
1.3　手性β-氨基醇的合成 3
1.3.1　化學法合成手性β-氨基醇 3
1.3.2　生物法合成手性β-氨基醇 9
參考文獻 19

第二章　β-氨基醇特異性轉(zhuǎn)氨酶高通量篩選方法的建立 26
2.1　引言 27
2.2　實驗材料與儀器 27
2.2.1　菌株來源 27
2.2.2　實驗試劑 28
2.2.3　實驗儀器 28
2.3　實驗方法 28
2.3.1　顯色反應條件探究 28
2.3.2　篩選方法靈敏度探究 29
2.3.3　轉(zhuǎn)氨酶的篩選 30
2.3.4　分析方法 30
2.4　結果與分析 30
2.4.1　顯色條件 30
2.4.2　篩選方法的靈敏度 33
2.4.3　全細胞空白對照 34
2.4.4　轉(zhuǎn)氨酶的篩選 34
2.5　小結 35
參考文獻 35

第三章　惡臭假單胞菌ω-轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆及其在手性β-氨基醇合成中的應用 36
3.1　惡臭假單胞菌中ω-轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆與重組表達 37
3.1.1　引言 37
3.1.2　實驗材料與儀器 37
3.1.3　實驗方法 39
3.1.4　結果與分析 42
3.1.5　小結 47
3.2　惡臭假單胞菌ω-轉(zhuǎn)氨酶酶學性質(zhì)表征及其底物特異性研究 48
3.2.1　引言 48
3.2.2　實驗材料 48
3.2.3　實驗方法 49
3.2.4　結果與分析 52
3.2.5　小結 58
參考文獻 59

第四章　結核分枝桿菌轉(zhuǎn)氨酶(MVTA)的克隆及其在手性β-氨基醇合成中的應用 60
4.1　引言 61
4.2　實驗材料與儀器 61
4.2.1　菌株與質(zhì)粒 61
4.2.2　試劑盒 61
4.2.3　實驗試劑 61
4.2.4　實驗儀器 62
4.2.5　培養(yǎng)基及其他試劑配制 63
4.3　實驗方法 64
4.3.1　引物設計及目的基因的PCR擴增 64
4.3.2　轉(zhuǎn)氨酶MVTA表達載體的構建及目的蛋白質(zhì)的表達與純化 65
4.3.3　酶活力測定方法 67
4.3.4　轉(zhuǎn)氨酶MVTA酶活力的適反應pH及pH穩(wěn)定性 68
4.3.5　轉(zhuǎn)氨酶MVTA酶活力的適反應溫度及溫度穩(wěn)定性 68
4.3.6　轉(zhuǎn)氨酶MVTA動力學參數(shù)和對映選擇性測定 68
4.3.7　轉(zhuǎn)氨酶MVTA不對稱胺化α-羥基酮氨基供體的篩選 69
4.3.8　轉(zhuǎn)氨酶MVTA不對稱胺化α-羥基酮 70
4.3.9　不同濃度二甲基亞砜對反應的影響 70
4.3.10　不同濃度R-苯乙胺對反應的影響 70
4.3.11　產(chǎn)物L-苯甘氨醇對反應的影響 71
4.3.12　產(chǎn)物苯乙酮對反應的影響 71
4.3.13　反應過程中底物濃度、反應時間和細胞用量對反應的影響 71
4.3.14　制備S構型苯甘氨醇 71
4.3.15　分析方法 71
4.4　結果與分析 72
4.4.1　重組載體的構建 72
4.4.2　MVTA目的蛋白質(zhì)的表達及純化 73
4.4.3　轉(zhuǎn)氨酶的適pH 73
4.4.4　轉(zhuǎn)氨酶pH穩(wěn)定性 74
4.4.5　轉(zhuǎn)氨酶的適溫度 74
4.4.6　轉(zhuǎn)氨酶溫度穩(wěn)定性 75
4.4.7　MVTA動力學參數(shù)和對映選擇性測定 76
4.4.8　MVTA動力學拆分外消旋β-氨基醇 77
4.4.9　不對稱胺化α-羥基酮氨基供體的選擇 78
4.4.10　pH對不對稱還原胺化反應的影響 78
4.4.11　溫度對不對稱還原胺化反應的影響 78
4.4.12　助溶劑二甲基亞砜（DMSO）濃度對不對稱還原胺化反應的影響 79
4.4.13　底物濃度和產(chǎn)物濃度對不對稱還原胺化反應的影響 80
4.4.14　細胞用量對不對稱還原胺化反應的影響 80
4.4.15　MVTA不對稱胺化α-羥基酮 81
4.4.16　制備S-苯甘氨醇 82
4.5　小結 83
參考文獻 84

第五章　巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)氨酶BMTA的克隆及其在手性鄰氨基醇合成中的應用 85
5.1　引言 86
5.2　實驗部分 87
5.2.1　材料與試劑 87
5.2.2　實驗方法 87
5.2.3　分析方法 90
5.3　結果與討論 90
5.3.1　ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA的表達、純化和酶活檢測 90
5.3.2　pH對ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA活性及穩(wěn)定性的影響 91
5.3.3　溫度對ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA活性及穩(wěn)定性的影響 91
5.3.4　ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA的底物特異性 92
5.3.5　ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA動力學拆分外消旋?-氨基醇 93
5.3.6　ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA不對稱還原胺化羥酮 93
5.3.7　ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA動力學拆分外消旋苯甘氨醇制備（S）-苯甘氨醇 94
5.4　小結 94
參考文獻 94

第六章　羰基還原酶組合轉(zhuǎn)氨酶級聯(lián)催化外消旋β-氨基醇同時制備手性β-氨基醇和手性鄰二醇 95
6.1　羰基還原酶的克隆與表達 96
6.1.1　引言 96
6.1.2　實驗材料與儀器 96
6.1.3　分析方法 98
6.1.4　實驗方法 99
6.1.5　實驗結果 103
6.1.6　小結 107
6.2  羰基還原酶酶學性質(zhì)表征 107
6.2.1　引言 107
6.2.2　實驗材料與儀器 108
6.2.3　分析方法 108
6.2.4　實驗方法 109
6.2.5　實驗結果 110
6.2.6　小結 115
6.3  羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶在E.coli中共表達及不對稱還原?-羥酮 116
6.3.1　引言 116
6.3.2　實驗材料與儀器 117
6.3.3　分析方法 117
6.3.4　實驗方法 118
6.3.5　實驗結果與分析 121
6.3.6  小結 128
6.4　級聯(lián)生物催化外消旋β-氨基醇同時制備手性β-氨基醇和鄰二醇 129
6.4.1　引言 129
6.4.2　實驗材料與儀器 129
6.4.3　實驗方法 130
6.4.4　分析方法 132
6.4.5　結果與分析 132
6.4.6　小結 139
參考文獻 140

第七章　環(huán)氨基醇特異性脫氨酶產(chǎn)生菌的篩選及其應用于手性環(huán)氨基醇的合成 141
7.1　高活力高選擇性環(huán)氨基醇脫氨酶產(chǎn)生菌的篩選 142
7.1.1　引言 142
7.1.2　實驗材料與儀器 142
7.1.3　實驗方法 144
7.1.4　結果與分析 148
7.1.5　小結 154
7.2　節(jié)桿菌環(huán)己胺氧化酶的克隆及其酶學性質(zhì)表征 155
7.2.1　引言 155
7.2.2　實驗材料與儀器 155
7.2.3　實驗方法 157
7.2.4　結果與分析 162
7.2.5　小結 170
參考文獻 171

第八章　生物催化環(huán)氧化物不對稱開環(huán)制備手性β-氨基醇 172
8.1　醇脫氫酶的篩選 173
8.1.1　引言 173
8.1.2　實驗材料 174
8.1.3　實驗方法 177
8.1.4　實驗結果分析 180
8.1.5  小結 182
8.2　立體選擇性級聯(lián)生物催化外消旋二醇合成手性β-氨基醇 183
8.2.1　引言 183
8.2.2　實驗材料 183
8.2.3　實驗方法 185
8.2.4　實驗結果 187
8.2.5　小結 191
8.3　三酶共表達重組菌的構建及催化苯乙二醇合成手性β-氨基醇 191
8.3.1　引言 191
8.3.2　實驗材料 191
8.3.3　實驗方法 192
8.3.4　實驗結果 195
8.3.5　小結 198
8.4　多酶級聯(lián)催化環(huán)氧化物不對稱開環(huán)合成手性β-氨基醇 198
8.4.1　引言 198
8.4.2　實驗材料 199
8.4.3　實驗方法 200
8.4.4　實驗結果 212
8.4.5　小結 222
參考文獻 223

第九章　級聯(lián)生物催化烯烴不對稱胺羥化合成手性β-氨基醇的研究 224
9.1　引言 225
9.2　實驗材料 225
9.2.1　實驗藥品 225
9.2.2　培養(yǎng)基 226
9.2.3　實驗儀器 226
9.3　實驗方法 227
9.3.1　重組大腸桿菌的構建 227
9.3.2　重組大腸桿菌的誘導表達 228
9.3.3　目的蛋白質(zhì)的酶活力檢測 228
9.3.4　凍干酶粉的制備 229
9.3.5  多酶級聯(lián)體系催化烯烴1a不對稱胺羥化合成手性β-氨基醇5a的條件優(yōu)化 229
9.3.6  多酶級聯(lián)體系催化烯烴1a～j不對稱胺羥化合成手性β-氨基醇5a～j 230
9.3.7　共表達體系的構建 231
9.3.8　兩種重組大腸桿菌細胞催化烯烴不對稱胺羥化合成手性β-氨基醇 235
9.3.9　共表達細胞催化烯烴不對稱胺羥化合成手性β-氨基醇 236
9.3.10  E.coli（CGS-DEM）和E.coli（CGS-DEB）制備手性β-氨基醇 237
9.3.11　氣相色譜分析法 237
9.4　結果與討論 239
9.4.1　重組大腸桿菌的構建 239
9.4.2  多酶級聯(lián)催化烯烴1a不對稱胺羥化合成手性β-氨基醇5a的條件優(yōu)化 240
9.4.3  多酶級聯(lián)催化烯烴1a～j不對稱胺羥化合成手性β-氨基醇5a～j 242
9.4.4　共表達體系的構建 243
9.4.5　兩種重組大腸桿菌細胞催化烯烴不對稱胺羥化合成手性β-氨基醇 245
9.4.6　共表達細胞催化烯烴不對稱胺羥化合成手性β-氨基醇 247
9.4.7  E.coli（CGS-DEM）和E.coli（CGS-DEB）制備手性β-氨基醇 249
9.5　小結 249
參考文獻 250