分子生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)戰(zhàn)技巧

目?? 錄

引言 001
第一章?? 建立哺乳動物細(xì)胞表面抗體展示技術(shù)平臺 002
第一節(jié)?? 多樣化的抗體篩選技術(shù) 002
一、雜交瘤技術(shù) 004
二、B 淋巴細(xì)胞單克隆技術(shù) 005
三、細(xì)胞表面抗體展示技術(shù) 005
四、哺乳動物細(xì)胞表面全長抗體展示技術(shù) 006
第二節(jié)?? 全長抗體在哺乳動物細(xì)胞表面的展示和分析 008
一、單基因表達(dá)系統(tǒng)的選擇 008
二、分泌型全長抗體的表達(dá)和分析 009
三、展示型全長抗體的表達(dá)和分析 012
四、抗原與展示型抗體的結(jié)合具有劑量依賴性 026
第三節(jié)?? 同步表達(dá)展示型和分泌型抗體 028
一、FCS（Furin 切割序列） 028
二、表達(dá)載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建 029
三、抗體表達(dá)細(xì)胞 030
四、展示型抗體的分析 032
五、分泌型抗體的分析 033
第二章?? 哺乳動物細(xì)胞表面抗體展示技術(shù)平臺的應(yīng)用 038
第一節(jié)?? 篩選抗原特異性抗體 038
第二節(jié)?? 分析不同抗體的表達(dá)強(qiáng)度 040
一、抗體的選擇 040
二、具體的實(shí)驗(yàn)和分析過程 040
第三節(jié)?? 篩選高親和力抗體 045
第四節(jié)?? 分析鑒定中和抗體 054
第三章?? 應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞表面抗體展示技術(shù)優(yōu)化抗體親和力 058
第一節(jié)?? 隨機(jī)突變展示型抗體基因庫的構(gòu)建及分析 058
一、抗體及突變位點(diǎn)的選擇 058
二、突變方案及引物設(shè)計(jì) 060
三、抗體基因庫的構(gòu)建及分析 060
第二節(jié)?? 細(xì)胞水平抗體庫的構(gòu)建及高中和活性抗體的篩選 063
一、細(xì)胞庫的構(gòu)建及分析 063
二、陽性抗體克隆的分選與分析 064
三、陽性抗體突變位點(diǎn)氨基酸的變化與中和活性的提高 065
第四章?? 展示型全長人源一級抗體庫的構(gòu)建及分析 067
第一節(jié)?? 表達(dá)載體的構(gòu)建 068
一、啟動子的選擇 068
二、限制性內(nèi)切酶的選擇 068
第二節(jié)?? 抗體基因庫的擴(kuò)增 078
一、基本思路 078
二、設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增引物 080
三、外周血淋巴細(xì)胞總 RNA 提取 084
四、基因庫 cDNA 第一鏈的合成 085
第三節(jié)?? 抗體庫的常規(guī)構(gòu)建 091
第四節(jié)?? 抗體庫的快速構(gòu)建 100
人源抗體重鏈可變區(qū)和全長輕鏈基因擴(kuò)增引物的分組 100
第五章?? 定向快速高效多片段分子克隆與二級抗體庫的構(gòu)建 114
第一節(jié)?? 需求與可行性 114
第二節(jié)?? 雙表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 116
一、雙表達(dá)載體需要的功能組分 116
二、雙表達(dá)載體的設(shè)計(jì) 117
三、引物的設(shè)計(jì)及 DNA 片段的 PCR 合成 118
四、4 片段定向連接構(gòu)建雙表達(dá)載體 119
五、分析雙表達(dá)載體的抗體表達(dá)功能 120
六、4 個片段的自我連接與定向連接分析 121
七、4 片段定向連接效率分析 123
第三節(jié)?? 用 4 片段定向連接快速高效構(gòu)建二級抗體庫 124
第六章?? 乙型肝炎病毒表面抗原特異性抗體的篩選 126
第一節(jié)?? 從抗體庫篩選特異性抗體的思路 126
一、一級抗體庫的特點(diǎn)及篩選難度 126
二、二級抗體庫與定點(diǎn)整合系統(tǒng)的局限性 127
三、從細(xì)胞展示抗體庫中篩選特異性抗體的設(shè)想 128
四、從定點(diǎn)整合二級免疫抗體庫開始是一個可行的方案 129
第二節(jié)?? 乙型肝炎特異性一級庫的構(gòu)建及分析 129
一、為什么選擇篩選乙型肝炎病毒表面抗原特異性抗體 129
二、PBMC 的需求及總 RNA 的提取 131
三、一級抗體庫的庫容及質(zhì)量分析 131
第三節(jié)?? 雙表達(dá)定點(diǎn)整合乙型肝炎特異性抗體庫的構(gòu)建及分析 134
一、載體水平定點(diǎn)整合乙型肝炎特異性抗體庫的庫容及質(zhì)量分析 134
二、定點(diǎn)整合抗體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞庫的構(gòu)建及質(zhì)量分析 136
三、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞庫的質(zhì)量分析及保存 137
第四節(jié)?? 乙型肝炎表面抗原特異性抗體的篩選與鑒定 139
一、抗原的確定和處理 139
二、表達(dá)抗 HBsAg 抗體細(xì)胞的富集 143
三、表達(dá)抗 HBsAg 抗體單細(xì)胞克隆的分析鑒定 146
第七章?? 實(shí)戰(zhàn)技巧專題討論 153
第一節(jié)?? 分子生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)材料的特點(diǎn)及操作技巧 153
一、DNA 與 PCR 154
二、RNA 與基因克隆 158
三、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及其變性 160
四、幾種特殊情況下的實(shí)用技巧 161
第二節(jié)?? 影響小提 RNA 質(zhì)量和產(chǎn)量的因素 167
一、RNA 酶與 RNA 的質(zhì)量產(chǎn)量 167
二、總 RNA 小提技巧 171
第三節(jié)?? 質(zhì)粒 DNA 的提取與鑒定 174
一、影響小提質(zhì)粒 DNA 產(chǎn)量質(zhì)量的因素 174
二、質(zhì)粒 DNA 小提技巧 179
三、陽性細(xì)菌克隆的篩選 184
四、質(zhì)粒 DNA 中提實(shí)例 190
第四節(jié)?? 瓊脂糖凝膠電泳操作技巧 200
一、DNA 瓊脂糖凝膠電泳的考慮因素 201
二、DNA 瓊脂糖凝膠電泳操作技巧 205
三、實(shí)例分析：用一塊凝膠同步分析從 0.5kb 到 10kb 的 DNA 片段 216
第五節(jié)?? 抗體庫的構(gòu)建與分析 218
一、構(gòu)建大容量抗體基因庫需要考慮的因素 219
二、抗體庫輕重鏈的配對分析與保存 229
三、抗體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞庫的構(gòu)建、染色、分析和分選 233
第六節(jié)?? 細(xì)胞生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)材料的特點(diǎn)及操作技巧 237
一、細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 238
二、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 242
參考文獻(xiàn) 246