目錄
第一部分 臨床和診斷病毒學
第一章 基孔肯雅病毒進化和流行病學 3
1.1 引言 3
1.2 病毒的傳播循環(huán)和媒介 3
1.3 病毒的歷史和起源 4
1.4 2004年以來基孔肯雅病毒的流行病學和感染傳播情況 5
1.5 基孔肯雅病毒在西半球的感染情況 6
1.6 結語 7
參考文獻 7
第二章 基孔肯雅病毒分子流行病學 10
2.1 引言 10
2.2 材料 12
2.2.1 病毒RNA的提取 12
2.2.2 一步法反轉錄-聚合酶鏈反應（One-step RT-PCR） 12
2.2.3 聚合酶鏈反應（PCR）產物的瓊脂糖凝膠電泳和純化 13
2.2.4 測序反應 13
2.2.5 PCR測序產物的純化 13
2.3 方法 14
2.3.1 病毒RNA的提取 14
2.3.2 一步法RT-PCR 14
2.3.3 瓊脂糖凝膠電泳和純化PCR產物 14
2.3.4 測序反應 15
2.3.5 純化循環(huán)測序產物 15
2.3.6 測序數(shù)據編輯 16
2.3.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 16
2.4 注釋 16
參考文獻 17
第三章 高級遺傳方法學在基孔肯雅病毒進化和傳播追蹤溯源研究中的應用 19
3.1 引言 19
3.2 材料 20
3.3 方法 20
3.3.1 序列生成 21
3.3.2 從公共數(shù)據庫獲得序列 21
3.3.3 多序列比對 21
3.3.4 序列多態(tài)性和基因突變分析 22
3.3.5 中值連接進化網絡的構建 23
3.3.6 生成一個時間尺度的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過BEAST軟件包計算目標序列到最近的共同祖先的時間（tMRCA）以確定祖先的年代 24
3.3.7 BEAST跟蹤輸出的可視化 26
3.3.8 用BEAST系統(tǒng)發(fā)育樹輸出方式構建最大分支可信度樹 27
3.3.9 一致最大分支可信度樹的可視化 27
3.3.10 通過BEAST2軟件進行系統(tǒng)地理學分析來確定病毒株時空傳播特點 27
3.3.11 用SPREAD軟件使系統(tǒng)地理學輸出可視化 29
3.4 注釋 29
參考文獻 32
第四章 基于合成肽的抗體檢測方法診斷有無神經系統(tǒng)并發(fā)癥的基孔肯雅病毒感染 34
4.1 引言 34
4.2 材料 35
4.2.1 單向電泳 35
4.2.2 雙向電泳 36
4.2.3 電洗脫 37
4.2.4 液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）分析 37
4.2.5 多肽合成 37
4.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 38
4.3 方法 38
4.3.1 單向電泳 38
4.3.2 雙向電泳 39
4.3.3 電洗脫 41
4.3.4 蛋白液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）分析 41
4.3.5 多肽合成41
4.3.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 42
4.4 注釋 43
參考文獻 44
第五章 E2糖蛋白在Sf9昆蟲細胞的表達和純化及其在血清學中的應用 45
5.1 引言 45
5.2 材料 46
5.2.1 昆蟲表達組件的構建 47
5.2.2 Sf9細胞的維持及E2糖蛋白的瞬時表達 47
5.2.3 在昆蟲細胞中穩(wěn)定表達E2糖蛋白 47
5.2.4 穩(wěn)定表達細胞的凍存 48
5.2.5 自然分泌CHIKV-E2的純化 48
5.2.6 基孔肯雅病毒的血清學診斷 48
5.3 方法 48
5.3.1 構建昆蟲表達組件 48
5.3.2 Sf9細胞的維持和E2糖蛋白的瞬時表達 49
5.3.3 E2糖蛋白在昆蟲細胞中的穩(wěn)定表達 50
5.3.4 穩(wěn)定細胞的低溫保存 51
5.3.5 純化自然分泌的CHIKV-E2蛋白 51
5.3.6 CHIKV的血清學診斷 52
5.4 注釋 53
參考文獻 54
第六章 基于血清學工具的CHIKV感染診斷方法 55
6.1 引言 55
6.2 材料 60
6.3 方法 61
6.3.1 血清樣品的準備 61
6.3.2 血清和病毒混合液的準備 62
6.3.3 細胞培養(yǎng) 62
6.3.4 用中和過的病毒感染細胞 62
6.3.5 計算結果 62
6.4 注釋 62
參考文獻 63
第七章 使用咽拭子及尿液標本診斷基孔肯雅病毒感染及其評價 65
7.1 引言 65
7.2 材料 66
7.2.1 病毒檢測 66
7.2.2 ELISA檢測IgM抗體 66
7.2.3 體外病毒分離 67
7.2.4 體內病毒分離 67
7.3 方法 67
7.3.1 通過分子生物學技術和測序分析檢測病毒基因組 67
7.3.2 IgM抗體捕獲-ELISA血清學檢測 68
7.3.3 體外病毒分離 69
7.3.4 體內病毒分離 70
7.4 注釋 70
參考文獻 71
第二部分 細胞培養(yǎng)、病毒復制和細胞反應
第八章 用蚊子細胞擴增基孔肯雅病毒 75
8.1 引言 75
8.2 材料 76
8.2.1 培養(yǎng)C6/36細胞 76
8.2.2 病毒擴增 76
8.3 方法 76
8.3.1 培養(yǎng)C6/36細胞 76
8.3.2 病毒擴增 77
8.4 注釋 78
參考文獻 79
第九章 基孔肯雅病毒感染的定量分析——病毒蝕斑試驗 81
9.1 引言 81
9.2 材料 82
9.3 方法 83
9.3.1 收集用于蝕斑試驗的樣本 83
9.3.2 接種BHK-21細胞于24孔板 84
9.3.3 蝕斑試驗 84
9.4 注釋 86
參考文獻 88
第十章 實時RT-PCR檢測與定量分析基孔肯雅病毒 90
10.1 引言 90
10.2 材料 91
10.2.1 寡核苷酸序列 91
10.2.2 病毒RNA提取 91
10.2.3 常規(guī)RT-PCR 91
10.2.4 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳及純化 92
10.2.5 體外轉錄合成cDNA 92
10.2.6 一步法SYBR Green I實時RT-PCR 92
10.2.7 一步法TaqMan實時RT-PCR 92
10.3 方法 92
10.3.1 病毒RNA提取 93
10.3.2 體外轉錄PCR產物的制備 93
10.3.3 瓊脂糖凝膠電泳及PCR產物純化 93
10.3.4 體外轉錄 94
10.3.5 RNA轉錄物的純化 94
10.3.6 總RNA產量的計算 94
10.3.7 體外轉錄RNA拷貝數(shù)測定 95
10.3.8 用于RNA絕對定量的標準品構建 95
10.3.9 基于SYBR-Green I的實時RT-PCR的絕對定量 95
10.3.10 基于TaqMan的實時RT-PCR的絕對定量 97
10.3.11 定量未知樣本中CHIKV載量 97
10.4 注釋 98
參考文獻 100
第十一章 伊蚊的基孔肯雅病毒感染 102
11.1 引言 102
11.2 材料 103
11.2.1 含CHIKV的血液（CHIKV血飼） 103
11.2.2 蚊子感染 103
11.2.3 從蚊子收集CHIKV 104
11.2.4 處理采集的蚊子臟器 104
11.3 方法 104
11.3.1 準備含病毒的血食物 104
11.3.2 蚊子感染 105
11.3.3 采集和處理受感染蚊蟲的臟器 106
11.3.4 處理采集的蚊蟲組織器官 108
11.4 注釋 108
參考文獻 109
第十二章 人工血食物感染蚊蟲中CHIKV的分析 111
12.1 引言 111
12.2 材料 112
12.2.1 蚊子的飼養(yǎng) 112
12.2.2 制備含感染性CHIKV的血食物 113
12.2.3 感染后蚊子的處理 113
12.2.4 核酸的檢測與定量 114
12.3 方法 115
12.3.1 埃及伊蚊和白紋伊蚊群落的飼養(yǎng) 115
12.3.2 蚊子感染性血飼流程 116
12.3.3 暴露后蚊子處理：通過分析CPE檢測蚊子中的病毒 117
12.3.4 暴露后蚊子處理：強迫唾液分泌 118
12.3.5 CHIKV核酸檢測與定量 119
12.4 注釋 119
參考文獻 121
第十三章 基孔肯雅病毒生長與熒光標記：免疫熒光法檢測基孔肯雅病毒 122
13.1 引言 122
13.2 材料 123
13.2.1 病毒生長 123
13.2.2 熒光顯微鏡 123
13.2.3 使用IFA進行血清學診斷 124
13.2.4 流式細胞術 124
13.3 方法 125
13.3.1 細胞生長 125
13.3.2 熒光顯微鏡下確定病毒的生長 125
13.3.3 應用IFA進行血清學診斷 126
13.3.4 流式細胞術測定病毒生長 127
13.4 注釋 127
參考文獻 128
第十四章 用蔗糖密度梯度分離和制備基孔肯雅病毒樣本用于透射電鏡觀察 130
14.1 引言 130
14.2 材料 131
14.2.1 CHIKV的分離與擴增 131
14.2.2 病毒純化 131
14.2.3 負染色和免疫金標記法 132
14.3 方法 132
14.3.1 分離CHIKV 132
14.3.2 CHIKV滴定 133
14.3.3 大規(guī)模擴增CHIKV用于病毒純化 134
14.3.4 聚乙二醇（PEG沉淀）純化病毒 134
14.3.5 不連續(xù)的蔗糖梯度純化病毒 135
14.3.6 負染法 136
14.3.7 免疫膠體金標記 136
14.4 注釋 137
參考文獻 138
第十五章 酵母雙雜交篩選法研究病毒-宿主蛋白的相互作用 139
15.1 引言 139
15.2 材料 141
15.2.1 GAL4 Y2H系統(tǒng)中使用的酵母菌株和質?！?41
15.2.2 培養(yǎng)基 141
15.2.3 酵母轉化 142
15.2.4 準備酵母蛋白提取物 143
15.2.5 BD病毒融合構建物自激活的檢測 144
15.2.6 病毒-宿主相互作用文庫的篩選 144
15.2.7 酵母菌落PCR 144
15.2.8 多重庫質粒的排除 145
15.2.9 限制性消化排除重復文庫質?！?45
15.
鄂公網安備 42010302001612號 